نام اختصاری:  HBV Quantitative Real-Time PCR

سایر نام ها: اندازه گیری کمی ویروس هپاتیت  Bبا روش Real-Time PCR،  Hepatitis B Quantitation، HBV DNA Quantitation،HBV DNA detection by Real time PCR  ، HBV viral Load

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: پلاسما، سرم، بافت کبد

حجم نمونه مورد نیاز:  5 ml

شرایط نمونه گیری:

1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.

2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1.        لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های حاوی EDTA صورت گیرد.

2.        پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.

3.        از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.

4.        پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC 20 – نگهداری شود.

5.        محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.

6.        در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.

7.        برای تهیه پلاسما از مواد ضد انعقاد EDTA یا سدیم سیترات استفاده شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1.       نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.

2.        قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.

3.        در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد.

شرایط نگهداری:

1. پس از جدا سازی سرم یا پلاسما در شرایط استریل، باید تا زمان انجام  آزمایش، آن را در دمای ºC 20 – نگه دارید.  سرم باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری از لخته جدا شده و  به صورت منجمد نگهداری شود. بافت کبد نیز باید تا زمان انجام آزمایش های بعدی در ^oC 20 – نگهداری شود.

2.  جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.

3. در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در ^oC 20 – فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

1. تأیید عفونت مزمن ویروس هپاتیت  B ( (HBV

2. تعیین کمی HBV-DNA  سرم بیماران مبتلا به عفونت مزمن HBV (سابقاً HBsAg  مثبت بوده اند.)

3. نظارت بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV

اطلاعات تکمیلی:

هپاتیت ویروسی مزمن ممکن است ناشی از عفونت با HBV یا HCV باشد. عفونت ممکن است منجر به یک حالت ناقل طولانی مدت و بیماری کبدی مزمن خفیف تا شدید شود. دو هفته پس از عفونت با هپاتیت B، می­توان مقدار زیادی از پروتئین ویروس (آنتی‏ژن سطحی ویروس) را در سرم و پس از آن پاسخ آنتی‏بادی به پروتئین‏های ویروس (anti-HBs) را ردیابی کرد. آنتی‏بادی­های ضد HBV در اکثریت بیماران برای تمام عمر پا بر جا می‏مانند. بهرحال حدود 10% از عفونت‏های HBV منجر به یک حالت ناقل مزمن می‏شود که مشخصة آن فقدان anti-HBs  است ولی anti-HBc و معمولاً HBsAg  باقی می‏مانند.  تشخیص این گونه موارد باید با ردیابی  HBV DNA  در سرم یا بافت کبد تکمیل شود. 

روش مرجع: Blot DNA Hybridization Based - Slot

 روش ارجح: DNA Detection and Quantification by Real-Time PCR

سایر روشها:  Qualitative DNA Detection Real-Time PCR، تکثیر DNA  با استفاده از روش PCR Conventional.

مقادیر طبیعی:  DNA ویروس  HBV در نمونه های سرم یا بافت کبدی افراد سالم وجود ندارد و ردیابی نمی شود. 

محدوده قابل سنجش (مثبت): IU/ml  10⁹ × 25 – 5

تفسیر:

کاوش پروبDNA ، یک اندازه‏گیری مستقیم HBV در سرم یا پلاسما را امکان­پذیر ساخته و با تیترهای آلایندگی (infectivity)  ارتباط دارد. اطلاعات حاصله از این آزمایش باید همراه با تست‏های سرولوژیک و  ردیابی HBsAg  مورد استفاده قرار گیرد HBV DNA حساس‏ترین مارکر برای عفونت جاری (ongoing) است. اندازه‏گیری کمی DNA ویروس ارزش پروگنوستیک داشته و از آن به عنوان پاسخی به درمان ضد ویروسی استفاده می‏شود. همزمان با پاک شدن عفونت از بدن، سطوح HBV DNA  و HBsAg افت می‏کند. در مراحل بعدی بیماری که آمینوترانسفرازها طبیعی می‏شوند، DNA  ویروس با تکنیک‏های هیبریداسیون منفی می‏شود ولی غالباً با PCR قابل ردیابی خواهد بود. ردیابی DNAنباید جای آزمایشات سرولوژیک را بگیرد.

عوامل مداخله گر :

·         هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.

·         نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

توضیحات:

·         نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNA ویروس هپاتیت  (HBV) B در نمونه یافت نشده است.

·         نتایج کمی بیان شده به واحد IU/ml  نشان دهنده میزان فعالیت ویروس HBV و تکثیر آن در بیمار است.

·         نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV نظارت می کند.

·         ارزیابی آزمایشگاهی وضعیت عفونت HBV باید با آزمایشات سرولوژیک  HBV آغاز گردد. از جمله، آزمایش از نظر وجود آنتی ژن سطحی هپاتیت B مورد ارزیابی قرار گیرد.

·         تشخیص عفونت مزمن  HBV صرفاً با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA  ویروس در نمونه سرم امکان پذیر نیست.

·         در صورت عدم وجود DNA ویروس در نمونه سرم بیمار و مثبت بودن Anti HBs، احتمال آلودگی به ویروس HBV رد نمی گردد.

         منابع :

1.     سایت مایو کلنیک:  . http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/88634

2. Jacobs S. D, DeMott R. W, Oxley K. D, Laboratory test handbook, 3 rd,Lexi comp,2004,P: 701-702

3.  Goedel S, Rullkoetter M, Weisshaar S, et al: Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV test, v2.0 in serum and plasma matrices. J Clin Virol 2009;45:232-236

4. Lok ASF, McMahon BJ: Chronic hepatitis B: Update 2009. Hepatology 2009;50:661-662

5. artus HBV RG PCR Kit handbook, QIAGEN